Naukowcy przeprojektowali kluczowy element szeroko stosowanego narzędzia do edycji genów opartego na CRISPR, zwanego Cas9, aby tysiące razy rzadziej celował w niewłaściwy odcinek DNA, a jednocześnie pozostawał tak samo skuteczny jak oryginalna wersja, co czyni go potencjalnie znacznie bezpieczniejszym .
Jednym z największych wyzwań związanych ze stosowaniem edycji genów opartej na CRISPR u ludzi jest to, że maszyneria molekularna czasami wprowadza zmiany w niewłaściwym odcinku genomu gospodarza, co stwarza możliwość przypadkowej próby naprawy mutacji genetycznej w jednym miejscu genomu stworzyć niebezpieczną nową mutację w innej.
Ale teraz naukowcy z University of Texas w Austin przeprojektowali kluczowy element szeroko stosowanego narzędzia do edycji genów opartego na CRISPR, zwanego Cas9, aby tysiące razy mniej prawdopodobne było celowanie w niewłaściwy odcinek DNA, a jednocześnie pozostało równie skuteczne. jako oryginalna wersja, dzięki czemu jest potencjalnie znacznie bezpieczniejsza. Praca została opisana w artykule opublikowanym dzisiaj w czasopiśmie Nature.
„To naprawdę może zmienić zasady gry pod względem szerszego zastosowania systemów CRISPR Cas w edycji genów” – powiedział Kenneth Johnson, profesor biologii molekularnej i współautor badania z Davidem Taylorem, adiunktem nauki biologiczne. Współpierwszymi autorami artykułu są stypendyści podoktorancki Jack Bravo i Mu-Sen Liu.
Inne laboratoria przeprojektowały Cas9, aby zredukować interakcje poza celem, ale jak dotąd wszystkie te wersje poprawiają celność, poświęcając szybkość. SuperFi-Cas9, jak nazwano tę nową wersję, jest 4000 razy mniej podatne na odcinanie stron docelowych, ale tak samo szybko jak naturalnie występujące Cas9. Bravo mówi, że można myśleć o różnych wersjach Cas9 generowanych w laboratorium jako o różnych modelach autonomicznych samochodów. Większość modeli jest naprawdę bezpieczna, ale ich prędkość maksymalna wynosi 10 mil na godzinę.
„Są bezpieczniejsze niż naturalnie występujące Cas9, ale wiąże się to z dużymi kosztami: idą niezwykle wolno” – powiedział Bravo. „SuperFi-Cas9 jest jak samojezdny samochód, który został zaprojektowany tak, aby był wyjątkowo bezpieczny, ale nadal może jechać z pełną prędkością”.
Do tej pory naukowcy wykazali zastosowanie SuperFi-Cas9 na DNA w probówkach. Teraz współpracują z innymi badaczami, którzy planują przetestować SuperFi-Cas9 pod kątem edycji genów w żywych komórkach. Pracują również nad opracowaniem jeszcze bezpieczniejszych i bardziej aktywnych wersji Cas9.
Narzędzia do edycji genów oparte na CRISPR zostały zaadaptowane z naturalnie występujących systemów w bakteriach. W naturze białko Cas9 unosi się w środowisku, szukając DNA z bardzo specyficzną sekwencją 20 liter, jak X na pirackiej mapie oznaczającej „kopać tutaj”. Czasami, gdy większość liter jest poprawna, z wyjątkiem tych w miejscach od 18 do 20, Cas9 nadal idzie naprzód i się zagłębia. Nazywa się to niedopasowaniem i może mieć katastrofalne konsekwencje w edycji genów.
Taylor i Johnson opracowali technikę zwaną określaniem struktury sterowanej kinetycznie, która wykorzystywała mikroskop krioelektronowy w laboratorium biologii strukturalnej Sauer do robienia migawek Cas9 w akcji podczas interakcji z tym niedopasowanym DNA.
Byli zaskoczeni, gdy odkryli, że kiedy Cas9 napotyka tego rodzaju niedopasowanie w pozycjach od 18 do 20, zamiast poddawać się i iść dalej, ma strukturę podobną do palca, która wpada i trzyma się DNA, dzięki czemu zachowuje się tak, jakby były poprawną sekwencją. Zwykle niezgodność sprawia, że DNA jest nieco niestabilne; ta struktura przypominająca palec stabilizuje go.
„To tak, jakbyś miał krzesło, a jedna z nóg została oderwana i po prostu sklejono ją ponownie taśmą” – powiedział Bravo. „Może nadal funkcjonować jako krzesło, ale może być trochę chwiejne. To dość brudna poprawka”.
Bez tej dodatkowej stabilności w DNA Cas9 nie podejmuje innych kroków potrzebnych do cięcia DNA i wprowadzania zmian. Nikt nigdy wcześniej nie zaobserwował tego dodatkowego palca wykonującego tę stabilizację.
„To było coś, czego nigdy bym sobie nie wyobrażał za milion lat” – powiedział Taylor.
Opierając się na tym spostrzeżeniu, przeprojektowali dodatkowy palec na Cas9, tak aby zamiast stabilizować część DNA zawierającą niedopasowanie, palec był odpychany od DNA, co uniemożliwia Cas9 kontynuowanie procesu cięcia i edycji DNA. Rezultatem jest SuperFi-Cas9, białko, które tnie właściwy cel równie łatwo, jak naturalnie występujące Cas9, ale jest znacznie mniej prawdopodobne, że tnie niewłaściwy cel.
Inni autorzy to Grace Hibshman, Tyler Dangerfield, Kyungseok Jung i Ryan McCool, również z The University of Texas w Austin.
Bravo, Liu, Hibshman, Dangerfield, Johnson i Taylor są wynalazcami wniosku patentowego obejmującego nowatorskie projekty Cas9 oparte na tej pracy. Biuro Komercjalizacji Technologii UT Austin zarządza własnością intelektualną i pracuje nad znalezieniem partnerów branżowych, którzy mogą pomóc w realizacji ogromnego potencjału technologii.
Praca ta była częściowo wspierana przez Fundację Welch oraz Fundację Roberta J. Kleberga, Jr. i Helen C. Kleberg. Taylor jest stypendystą CPRIT wspieranym przez Instytut Profilaktyki i Badań nad Rakiem w Teksasie. Taylor jest również wspierany przez David Taylor Excellence Fund in Structural Biology, który jest możliwy dzięki wsparciu Judy i Henry’ego Sauer.