Przekształcanie jednego rodzaju komórki do drugiego – na przykład komórki skóry w neuron – można wykonać w procesie, który wymaga indukowania komórki skóry w „pluripotencyjną” komórkę macierzystą, a następnie różnicować się w neuron. Naukowcy z MIT opracowali teraz uproszczony proces, który omija stadium komórek macierzystych, przekształcając komórkę skóry bezpośrednio w neuron.
Współpracując z komórkami myszy, naukowcy opracowali metodę konwersji, która jest wysoce wydajna i może wytwarzać więcej niż 10 neuronów z pojedynczej komórki skóry. Jeśli powielone w ludzkich komórkach, takie podejście może umożliwić wytwarzanie dużych ilości neuronów ruchowych, które można potencjalnie zastosować w leczeniu pacjentów z urazami rdzenia kręgowego lub chorób, które upośledzają ruchliwość.
„Byliśmy w stanie osiągnąć plony, w których moglibyśmy zadawać pytania o to, czy komórki te mogą być żywotnymi kandydatami na terapie wymiany komórek, które, mamy nadzieję, mogą być. W tym miejscu mogą nas zabrać tego rodzaju technologie przeprogramowania”, mówi Katie Galloway, profesor rozwoju kariery WM Keck w inżynierii biomedycznej i inżynierii chemicznej.
Jako pierwszy krok w kierunku rozwoju tych komórek jako terapii naukowcy wykazali, że mogą generować neurony ruchowe i wszczepić je do mózgów myszy, gdzie zintegrowali się z tkanką gospodarza.
Galloway jest starszym autorem dwóch artykułów opisujących nową metodę, która pojawia się dzisiaj w systemach komórkowych. Nathan Wang, absolwent MIT, jest głównym autorem obu dokumentów.
Od skóry po neurony
Prawie 20 lat temu naukowcy w Japonii wykazali, że dostarczając cztery czynniki transkrypcyjne do komórek skóry, mogliby ich nakłonić, aby stać się indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi (IPSC). Podobnie jak zarodkowe komórki macierzyste, iPSC można różnicować na wiele innych typów komórek. Ta technika działa dobrze, ale zajmuje to kilka tygodni, a wiele komórek nie kończy się w pełni przechodzi na dojrzałe typy komórek.
„Często jednym z wyzwań w przeprogramowaniu jest to, że komórki mogą utknąć w stanach pośrednich” – mówi Galloway. „Tak więc używamy bezpośredniej konwersji, gdzie zamiast przejść przez IPSC pośredni, przechodzimy bezpośrednio z komórki somatycznej do neuronu ruchowego”.
Grupa badawcza Gallowaya i inni wykazali wcześniej tego rodzaju bezpośrednią konwersję, ale z bardzo niskimi wydajnościami – mniej niż 1 procent. W poprzedniej pracy Gallowaya zastosowała kombinację sześciu czynników transkrypcyjnych oraz dwóch innych białek, które stymulują proliferację komórek. Każdy z tych ośmiu genów dostarczono przy użyciu oddzielnego wektora wirusowego, co utrudnia zapewnienie, że każdy został wyrażany na właściwym poziomie w każdej komórce.
W pierwszym z nowych artykułów systemów komórkowych Galloway i jej uczniowie zgłosili sposób usprawnienia procesu, aby komórki skóry mogły być przekształcane w neurony ruchowe przy użyciu zaledwie trzech czynników transkrypcyjnych, plus dwa geny, które napędzają komórki w stan wysoce proliferacyjny.
Korzystając z komórek myszy, naukowcy rozpoczęli od pierwotnych sześciu czynników transkrypcyjnych i eksperymentowali z ich upuszczeniem, po jednym na raz, dopóki nie osiągnęli kombinacji trzech – NGN2, ISL1 i LHX3 – które mogłyby z powodzeniem zakończyć konwersję do neuronów.
Gdy liczba genów spadła do trzech, naukowcy mogli użyć jednego zmodyfikowanego wirusa, aby dostarczyć wszystkie trzy z nich, pozwalając im upewnić się, że każda komórka wyraża każdy gen na odpowiednich poziomach.
Korzystając z oddzielnego wirusa, naukowcy dostarczyli również geny kodujące p53dd i zmutowaną wersję HRAS. Geny te napędzają komórki skóry do dzielenia się wiele razy, zanim zaczną konwertować na neurony, umożliwiając znacznie wyższą wydajność neuronów, około 1100 procent.
„Gdybyś wyrażał czynniki transkrypcyjne na naprawdę wysokich poziomach w komórkach nieproliferacyjnych, szybkości przeprogramowania byłyby naprawdę niskie, ale komórki hiperproliferacyjne są bardziej receptywne. To tak, jakby były wzmocnione w celu konwersji, a następnie stają się znacznie bardziej receptywne na poziomy czynników transkrypcyjnych” – mówi Galloway.
Naukowcy opracowali również nieco inną kombinację czynników transkrypcyjnych, które pozwoliły im wykonywać tę samą bezpośrednią konwersję za pomocą komórek ludzkich, ale o niższym wskaźniku wydajności – od 10 do 30 procent, jak szacują naukowcy. Proces ten trwa około pięciu tygodni, co jest nieco szybsze niż najpierw przekształcenie komórek na IPSC, a następnie przekształcenie ich w neurony.
Implanowanie komórek
Gdy naukowcy zidentyfikowali optymalną kombinację genów do dostarczenia, zaczęli pracować nad najlepszymi sposobami ich dostarczenia, co było przedmiotem dokumentu drugiego systemu komórek.
Wypróbowali trzy różne wirusy dostawy i stwierdzili, że retrowirus osiągnął najbardziej wydajny szybkość konwersji. Zmniejszenie gęstości komórek hodowanych w naczyniu pomogło również poprawić ogólną wydajność neuronów ruchowych. Ten zoptymalizowany proces, który zajmuje około dwóch tygodni w komórkach myszy, osiągnął wydajność ponad 1000 procent.
Współpracując z kolegami z Boston University, naukowcy przetestowali, czy te neurony ruchowe można skutecznie wszczepić na myszy. Dostarczali komórki do części mózgu zwanej prążkiem, która jest zaangażowana w kontrolę motoryczną i inne funkcje.
Po dwóch tygodniach naukowcy odkryli, że wiele neuronów przeżyło i wydawało się tworzyć połączenia z innymi komórkami mózgowymi. Po hodowaniu w naczyniu komórki te wykazały mierzalną aktywność elektryczną i sygnalizację wapnia, co sugeruje zdolność komunikacji z innymi neuronami. Naukowcy mają teraz nadzieję zbadać możliwość wszczepienia tych neuronów do rdzenia kręgowego.
Zespół MIT ma również nadzieję na zwiększenie wydajności tego procesu konwersji komórek ludzkich, co może pozwolić na wytwarzanie dużych ilości neuronów, które mogłyby być stosowane w leczeniu urazów rdzenia kręgowego lub chorób, które wpływają na kontrolę ruchu, takie jak ALS. Obecnie trwają badania kliniczne z wykorzystaniem neuronów pochodzących z IPSC do leczenia ALS, ale rozszerzenie liczby komórek dostępnych do takich metod leczenia może ułatwić testowanie i rozwój ich w celu bardziej rozpowszechnionego stosowania u ludzi, mówi Galloway.
Badania zostały sfinansowane przez National Institute of General Medical Sciences i National Science Foundation Graduate Research Fellowship.